Фтизиатрия:

Популярные разделы сайта:

Исследование мокроты на туберкулез (микобактерии, МБТ) - методика

Уточнению диагноза туберкулеза органов дыхания способствует проведение лабораторных анализов мокроты и плеврального выпота на микобактерии туберкулеза (МБТ). Мокрота для исследования собирается утром в стерильную баночку, которая хранится закрытой. Если мокроты мало, необходимо предложить больному собирать ее при откашливании в течение суток.

При отсутствии мокроты используются раздражающие ингаляции или получают промывные воды бронхов. Чтобы выявить микобактерии туберкулеза, мокроту исследуют троекратно до назначения противотуберкулезных препаратов. При этом используются бактериоскопический, культуральный и биологический методы выявления МБТ.

Бактериоскопией микобактерии туберкулеза выявляются при наличии их не менее 100 000 в 1 мл. Анализ мокроты в лаборатории начинается с макроскопического описания. Микроскопия нативного мазка позволяет выявить в мокроте эритроциты, эластические волокна (ЭВ) из легочной ткани, коралловидные волокна (волокна Коппена—Джонса), кристаллы Шарко—Лейдена, спириллы Куршмана, клетки сердечных пороков.

В мокроте больных туберкулезом вместе с микобактериями туберкулеза можно обнаружить темные зерна различной величины. Они попадают в мокроту из старых, распадающихся очагов. При этом С. Л. Эрлих объединил все это в так называемую «тетраду», которая включает четыре признака:

1) микобактерии туберкулеза (МБТ) при микроскопии;

2) кристаллы холестерина;

3) кристаллическая или аморфная известь;

4) коралловидные волокна.

Обнаружение этих признаков в мокроте свидетельствует об обострении в легочной ткани старого туберкулезного процесса. Дальнейшее исследование мокроты проводится методом отбора. Собранную мокроту переливают в чашку Петри, которую устанавливают на черную бумагу.

Деревянной палочкой отбирают гнойные комочки и переносят на предметное стекло. Другим таким же стеклом комочки растирают. Один препарат исследуют в нативном виде, другой исследуют на МБТ при световой или люминесцентной микроскопии после специальной окраски. При световой микроскопии окраску проводят по Цилю—Нильсену: карболовый фуксин, 3 % раствор солянокислого спирта, 0,25 % раствор метиленового синего.

Препараты микроскопируют с иммерсией. МБТ в них окрашиваются в красный цвет и бывают расположенными внутри или внутриклеточно. Эффективность бактериоскопии возрастает до 30 % при использовании люминесцентной микроскопии. Для этого препараты окрашивают аурамином или родамином. При микроскопии микобактерии туберкулеза (МБТ) на темном фоне ярко сверкают золотисто-зеленым или золотисто-фиолетовым светом.

В тех случаях, когда микобактерии туберкулеза (МБТ) не удалось выявить методом отбора, дальнейшие исследования мокроты на микобактерии туберкулеза (МБТ) проводят методом флотации (обогащения) исследуемого материала. На первом этапе флотации проводится гомогенизация 15—20 мл мокроты путем добавления щелочи, встряхивания и подогревания, а на втором — собственно обогащение.

Обогащение осуществляется центрифугированием или флотацией. При флотации в гомогенизированный материал добавляют до 180 мл дистилированную воду, 2 мл органического растворителя (бензин, бензол, ксилол) и производят встряхивание на специальном аппарате в течение 20 мин. После этого в сосуд доливают доверху воду. Из флотационного кольца готовят препараты и исследуют их в микроскопе после соответствующей окраски. Флотация повышает чувствительность бактериоскопии в 10 раз.

Широкое использование в клинических условиях культурального и биологического методов выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) повышает эффективность микробиологической диагностики.

Материалы: http://dommedika.com/ftiziatria/issledovanie_mokroti_na_tuberkulez.html

Все, что Вы хотите знать о туберкулезе

В.Ю. Мишин

Для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале больных применяют следующие методы: микроскопию препаратов патологического материала по методу Циля-Нельсена; люминесцентную микроскопию патологического материала; полимеразно-цепную реакцию; бактериологический (культуральный) метод.

Микроскопия препаратов патологического материала по методу Циля- Нельсена является основным методом выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

На основании микроскопического исследования можно сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате КУМ. Это объясняется тем, что в природе существует большое разнообразие видов микобактерий, включая и нетуберкулезные, одинаково хорошо воспринимающих окраску раствором карболового фуксина.

Мазки патологического материала обрабатывают карболовым фуксином, а затем обесцвечивают 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта. Докрашивают мазки 0,25% раствором метиленового синего.

Окрашенные препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. КУМ окрашиваются в красный, а окружающий фон — в синий.

При микроскопическом исследовании препарата, окрашенного по методу Циля-Нельсена, следует просматривать не менее 100 полей зрения, что обычно вполне достаточно, чтобы обнаружить в препарате единичные КУМ. В том случае, если результат исследования оказывается отрицательным, для подтверждения необходимо просмотреть дополнительно 200 полей зрения.

Результат исследования возможно получить в течение 1 ч, но обычно его выдают через 24 ч. Значимыми преимуществами бактериоскопического выявления КУМ в патологическом материале больных туберкулезом является доступность метода, его экономичность и быстрота получения результата. Вместе с тем метод относительно малочувствителен (необходимо, чтобы в 1 мл исследуемого материала содержалось не менее 50—100 тыс. микробных тел) и недостаточно специфичен.

Люминесцентная микроскопия увеличивает разрешающую способность микроскопии по сравнению с окраской по Цилю-Нельсену на 14—30%. Для окраски используют флюорохромы — органические красители, флюоресцирующие при освещении ультрафиолетовыми, фиолетовыми или синими лучами. Такими красителями являются аурамин 00 и родамин С.

Препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа: микобактерии светятся золотисто-желтым цветом на темном фоне. Количество КУМ, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень важным информационным показателем, так как характеризует степень эпидемической опасности больного и тяжесть заболевания.

Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но обязательно и количественным. При использовании объектива 90х-100х и окуляра микроскопии мазка мокроты 7х— 10х(общее увеличение — 630х— ЮООх) принята следующая градация результатов световой иммерсионной микроскопии по методу Циля-Нельсена, представленная в таблице:

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) является одним из наиболее быстрых и информативных методов выявления МБТ. Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК МБТ, катализируемого in vitroRH К-полимеразой в автоматическом режиме.

В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического или определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности. Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликоны) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.

К достоинствам метода ПЦР относятся:

  • высокая чувствительность, позволяющая определять 10—100 клеток в биологической пробе;
  • высокая специфичность ДНК МБТ в исследуемом материале;
  • универсальность процедуры обнаружения МБТ из одной биологических проб;
  • высокая скорость анализа (4—4,5 ч).

Вместе с тем высокая разрешающая способность метода в ряде случаев может приводить к ложноположительным результатам, что ограничивает достоверность исследования.

Бактериологический (культуральный) метод выявления МБТ заключается в посеве мокроты и другого патологического материала на питательные среды. Для эффективного выделения культуры МБТ достаточно единичных жизнеспособных бактериальных клеток (20-100 микробных тел) в образце диагностического материала. Рост культуры регистрируют за 21-90 сут.

Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить три основные группы: плотные питательные среды на яичной основе; плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе; жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды. В России наиболее широкое распространение получила плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена.

Среду Левенштейна-Йенсена применяют во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Рост МБТ на этой среде проявляется в диапазоне от трех недель до трех месяцев (в среднем 1,5 мес).

Вирулентные культуры МБТ обычно растут на плотных питательных средах в виде R-колоний (от англ. rough — грубый, шершавый) различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту.

Интенсивность роста МБТ определяют по трехбалльной системе: «+» 1 — 20 колоний (скудное бактериовыделение); «++» 21—100 колоний (умеренное бактериовыделение); «+++» более 100 колоний (обильное бактериовыделение).

Лекарственную устойчивость МБТ определяют методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна— Йенсена, основанной на добавлении определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл.

Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 107 микробных тел.

Уровень устойчивости данного штамма МБТ в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение МБТ. Для различных противотуберкулезных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма.

Для метода абсолютных концентраций появление более 20 колоний на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат, в критической концентрации свидетельствует о том, что данный штамм МБТ обладает лекарственной устойчивостью.

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов при определении лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена составляют для:

  • изониазида 1 мкг/мл;
  • рифампицина — 40 мкг/мл;
  • пиразинамида — 200 мкг/мл;
  • этамбутола — 2 мкг/мл;
  • стрептомицина — 10 мкг/мл;
  • канамицина — 30 мкг/мл;
  • капреомицина — 30 мкг/мл;
  • протионамида (этионамида) — 30 мкг/мл;
  • циклосерина — 30 мкг/мл;
  • ПАСК — 1 мкг/мл;
  • офлоксацина — 2 мкг/мл.

В большинстве случаев метод абсолютных концентраций применяется для непрямого определения лекарственной устойчивости. Вначале производят посевы мокроты на твердые питательные среды и получают чистую культуру МБТ, которую пересевают на питательные среды, содержащие определенные концентрации противотуберкулезных препаратов.

Так как сроки выделения МБТ на питательных средах составляют

не менее 1,5 мес, то результаты определения устойчивости указанным методом обычно получают не ранее чем через 2—2,5 мес после посева материала.

Кроме описанных выше классических методов культивирования МБТ и определения лекарственной устойчивости, в России нашли свое применение следующие современные системы.

Система ВАСТЕС460 — радиометрический метод быстрого определения роста МБТ путем регистрации уровня меченного С02, образующегося в процессе утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный С14. Для роста МБТ в данной системе используют флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную среду Middlebrook 7H9, содержащую радиоактивный С14. При размножении МБТ утилизируют С14 и выделяют С1402; в этом случае учет идет по нарастанию С1402.

Система ВАСТЕС MGIT960 — индикаторные пробирки MGIT (М. Growth Indicator Tube) с той же средой Middlebrook 7Н9; содержат в придонной части флюоресцирующий индикатор (трис-4,7-дифкнил-1, Юфенантролин рутениум хлорид пентагидрат), «погашенный» высокими концентрациями 02. В процессе роста МБТ поглощают 02, что сопровождается усилением свечения индикатора, интенсивность которого оценивают при помощи трансиллюминатора.

Полностью автоматизированный комплекс позволяет одновременно исследовать лекарственную чувствительность МБТ в 960 исследуемых образцах.

Наличие роста МБТ в системе ВАСТЕС регистрируется на 4—5-й день от момента посева. В системе ВАСТЕС, где используют те же абсолютные концентрации противотуберкулезных препаратов, учет лекарственной устойчивости идет в течение 6 нед.

В последние годы для быстрого определения лекарственной устойчивости используют метод микрочипов, основанный на молекулярно-генетическом анализе (ПЦР) выявления точечных мутаций в гроВ гене, ответственном за устойчивость к рифампицину, и в katG гене, ответственном за лекарственную устойчивость к изониазиду.

Установлено, что более 95% устойчивых к рифампицину штаммов МБТ содержат точечные мутации (делеции и вставки в гроВ гене, кодирующих Р-субъединицу РНК-полимеразы), и что более 70% устойчивых к изониазиду штаммов МБТ имеют делеции и вставки в katG гене, кодирующих каталазу/пероксидазу. Результаты метода микрочипов могут быть получены на 3-4-й день исследования.

Материалы: http://ftiza.su/mikrobiologicheskie-metodyi-issledovaniya-pri-tuberkuleze/